非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用，抗體與組織之間的離子相互作用，以及與能夠影響IHC檢測系統(tǒng)的內源分子的相互作用。這些問題會產生高背景，以及無法在適當?shù)募毎恢糜^察目的抗原。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決。在將樣本與一抗共同孵育之前，可開展這些步驟
預防非特異疏水相互作用
盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結合中起了重要作用，但這些力同樣能促進非特異結合。由于一些氨基酸的中性側鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，是降低非特異疏水結合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預防與一抗或二抗的相互作用，或預防與待染色組織/細胞的相互作用很重要。例如，在使用山羊來源的一抗時，不建議用山羊血清作為封閉劑。而是推薦與二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去污劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。
預防非特異離子相互作用
如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷，那么離子相互作用可能導致非特異的背景染色。例如，非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用。范德華力、兩級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強度能降低離子相互作用。不過，表位-抗體結合通常依賴于離子強度，因此這種方法也可能負面影響染色特異性。由于單克隆抗體的單表位特異性，與多克隆抗體相比，增加離子強度更可能損害其性能。
內源酶的干擾
顯色檢測法常使用一種結合的酶來觀察表位-抗體的相互作用。在使用這種檢測方法時，同一種酶的內源活性必須被封閉。例如，包含辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號。腎、肝或帶有紅細胞的血管區(qū)域等組織含有內源的過氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的過氧化物酶封閉液能用于防止內源的過氧化物酶切割底物。
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