ELISA法檢測(cè)HIV抗體的影響因素

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是一種常用的固相免疫測(cè)定方法，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測(cè)定。《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》（2009年修訂版）中要求：各篩查實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，先用第一種篩查試劑（高敏感性ELISA）檢測(cè)，出現(xiàn)陰性反應(yīng)報(bào)告“HIV抗體陰性"，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)不可直接報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果，則用另一種不同原理或不同廠家的篩查試劑（高特異性ELISA）復(fù)檢，所以ELISA法目前普遍用于艾滋病病毒抗體（HIV抗體）初篩實(shí)驗(yàn)室用于HIV抗體的測(cè)定，但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且對(duì)檢驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求也較高，因此，為了得到準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，必須對(duì)ELISA法中的諸多影響因素采取相應(yīng)的控制措施。目前，HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室常用的是血液標(biāo)本。血液標(biāo)本常見(jiàn)的干擾因素有內(nèi)源性干擾和外源性干擾。

內(nèi)源性干擾因素：包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體等，這些因素的存在，常使結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性等偏差，針對(duì)這些問(wèn)題，解決辦法：（1）用0.01mol/L，pH7.2PBS（磷酸鹽緩沖液）將標(biāo)本做1:1稀釋?zhuān)唬?/span>2）溫度56℃、時(shí)間30min將血清滅活。

外源性干擾因素：外源性干擾物質(zhì)常常是由于血液標(biāo)本在采集、保存、運(yùn)送等過(guò)程中操作不當(dāng)所造成，比如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間久、標(biāo)本凝集不全或加入抗凝血物質(zhì)等。針對(duì)這些問(wèn)題，解決辦法：（1）盡量避免樣品溶血；（2）標(biāo)本采集后應(yīng)室溫下自然防置1h～2h，待血液凝固、xue塊收縮后再用1500~3000r/min離心15min，吸出血清；（3）血清標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于不能立即測(cè)定的標(biāo)本，需2℃~8℃保存，超過(guò)一周以上測(cè)定的標(biāo)本應(yīng)-20℃以下保存；（4）標(biāo)本中加入抗凝物質(zhì)時(shí)，盡量避免使用酶抑制劑，以免造成對(duì)ELISA中酶活性的影響。

試劑的選擇：應(yīng)使用經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)的、敏感性高、特異性好的試劑；更換試劑批號(hào)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行平行試驗(yàn)；試劑盒嚴(yán)格控制在有效期內(nèi)使用。

試劑的預(yù)處理：在ELISA法測(cè)定時(shí)試劑的預(yù)處理非常關(guān)鍵，也是較容易忽略的一個(gè)步驟，具體的做法：每次試驗(yàn)前，將試劑盒從冰箱內(nèi)取出，室溫下放置20min～30min，使試劑盒在使用前與室溫基本平衡一致，以免影響到抗原抗體的結(jié)合與反應(yīng)的速度。

溫度：是ELISA法測(cè)定中最為重要的一個(gè)問(wèn)題，它直接決定著試驗(yàn)的成敗，所以在HIV抗體測(cè)定中一定要注意溫度的控制。ELISA以酶催化底物顯色來(lái)判斷結(jié)果，而抗原與抗體的合和酶催化底物的效率均與溫度密切相關(guān)，溫度高，顯色深，S/CO值高，反之，顯色淺，S/CO值低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在日常實(shí)際操作時(shí)，常忽略從室溫平衡的溫度逐步上升到37℃需要17min。為保證37℃下有足夠的反應(yīng)時(shí)間，各實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)板在恒溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計(jì)單獨(dú)放置在非檢測(cè)樣品的空白板孔溶液中測(cè)量觀察。

加樣操作：加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，加完后輕輕晃動(dòng)混勻，并在酶標(biāo)板上加覆膜。

洗滌與浸泡：反應(yīng)板的洗滌次數(shù)及浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短，也直接影響著檢測(cè)結(jié)果，一般洗滌5～6次，浸泡時(shí)間每次為50s，洗滌次數(shù)過(guò)多或過(guò)少、浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短容易造成假陰性或假陽(yáng)性。

酶標(biāo)儀讀板：每次測(cè)定標(biāo)本吸光度前，要將酶標(biāo)儀開(kāi)機(jī)預(yù)熱不低于20min，而且要在15min

內(nèi)判讀完畢。

室內(nèi)質(zhì)控品：是非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，用來(lái)判斷本次實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)的有效性。可以是商品或?qū)嶒?yàn)室自行制備。以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2-3倍為宜。每次試驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無(wú)效，必須重新實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于我們每一位檢驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，不管是檢驗(yàn)標(biāo)本，還是檢驗(yàn)試劑、試驗(yàn)溫度、儀器設(shè)備等等，只要把握好每個(gè)環(huán)節(jié)，就可以消除ELISA法在檢測(cè)HIV抗體中的諸多影響因素，就能保證為每位檢測(cè)者提供準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。