免疫熒光法操作步驟

一．實(shí)驗(yàn)器材：

1． 器材：

40孔塑料板、40孔板離心機(jī)、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等。

2． 試劑：

單抗隆抗體（單抗）、熒光標(biāo)記抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、疊氮鈉（NaN3）等。

二．方法（微量法）

1． 將分離好的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分鐘。用含0.1% NaN3 PBS調(diào)細(xì)胞濃度在0.5-1×108/ml（5000萬-1億/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105細(xì)胞，然后加入單抗（*抗 體）50ul（同時(shí)加入AB型血清5ul）振蕩混勻，置4℃，至少30分鐘。

2． 用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm離心3-5分鐘棄上清。

3． 加熒光標(biāo)記抗鼠抗體（第二抗體）工作液20ul，混勻振蕩置4℃/30分鐘（時(shí)間不能超過）。

4． 用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，棄上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依據(jù)所加細(xì)胞量而定）振蕩均勻，點(diǎn)片，并加蓋玻片。

如想次日看結(jié)果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔50ul，混勻置4℃過夜，次日離心棄上清按四步做法觀察結(jié)果（為膜熒光）。