什么是間接凝集反應(yīng)
將可溶性抗原吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)比直接凝集反應(yīng)敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。本實(shí)驗(yàn)介紹了間接凝集反應(yīng)兩種主要方法：間接血球凝集試驗(yàn)、間接凝集抑制試驗(yàn)和協(xié)同凝集試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)原理
1. 間接血球凝集試驗(yàn)是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來(lái)的。將細(xì)菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時(shí)紅血球即稱為“致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細(xì)菌的抗原性，與相應(yīng)的抗血清相遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。
間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質(zhì)浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質(zhì)時(shí)則用來(lái)吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。
2. 若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先混合，充分作用后再加入有關(guān)的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動(dòng)凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗(yàn)，臨床化驗(yàn)檢查中常用的免疫妊娠試驗(yàn)就是一種間接凝集抑制試驗(yàn)。妊娠試驗(yàn)：孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當(dāng)往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時(shí)，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體被消耗，此時(shí)再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒）。不發(fā)生反應(yīng)，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當(dāng)膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。出現(xiàn)均勻細(xì)小顆粒，妊娠試驗(yàn)為陰性。
3. 金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動(dòng)物（豬、兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體的Fc段結(jié)合。IgG的Fe段與SpA結(jié)合后，兩個(gè)Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當(dāng)其與特異性抗原相遇時(shí)，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應(yīng)中，金黃色葡萄球菌菌體成了IgG抗體的載體,稱為協(xié)同凝集反應(yīng).本反應(yīng)也可用于檢測(cè)微量抗原。
實(shí)驗(yàn)步驟
間接血球凝集試驗(yàn)：
材料：
1．抗原—傷寒桿菌O抗原
2．免疫血清：傷寒桿菌O901免疫兔血清
3．25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等
方法：
1．“O”抗原的制備：
將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時(shí)，離心沉淀吸取上清夜，分裝無(wú)菌試管，放4℃冰箱備用。
2．致敏紅血球懸液制備：
取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經(jīng)2小時(shí)。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，而配制成0.5%懸液即成。
3．試驗(yàn)步驟：
1） 小試管9只標(biāo)好號(hào)碼于試管架上。
2） 第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。
3） 以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9管不加血清作對(duì)照。
4） 于每管加入0.5毫升已經(jīng)致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放入37℃水浴中2小時(shí)后觀察結(jié)果。凡zui高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現(xiàn)*血凝者，即為該血清的間接血清效價(jià)。
間接凝集抑制試驗(yàn)：
材料：
1．抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原
2．抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清
3．被檢材料：孕婦尿
4．正常尿作對(duì)照用
5．黑反應(yīng)板1塊
6．滴管3只
方法：
1．用清潔滴管在反應(yīng)板上滴加一滴被檢尿。
2．再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動(dòng)，充分混勻。
3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動(dòng)3—5分鐘，在較強(qiáng)光線下，觀察結(jié)果。出現(xiàn)均勻一致的細(xì)小顆粒為陰性反應(yīng)，懷孕。
注意事項(xiàng)：
1．試驗(yàn)材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）
2．被檢尿太混濁，需要小心過(guò)濾。
3．尿中有蛋白及血液時(shí)，不宜進(jìn)行此試驗(yàn)。
協(xié)同凝集試驗(yàn)
材料：
1. 抗原:可溶性傷寒桿菌O抗原
2. 免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清
3. 10%CoWan1株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液
4. PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等
方法：
1．10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWan1株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘。沉淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室溫中固定3小時(shí)。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。
2．致敏葡萄球菌：
1毫升10%的菌懸液加0.1毫升傷寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分鐘（中間需搖動(dòng)兩次）。取出后經(jīng)每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘，棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。
3．協(xié)同凝集試驗(yàn)
1） 取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生凝集。
2） 滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒O菌培養(yǎng)物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無(wú)凝集。
3） 用傷寒“O”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養(yǎng)物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應(yīng)，不出現(xiàn)凝集。
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